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關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)你了解了多少

更新時(shí)間:2020-04-20      點(diǎn)擊次數(shù):3050
   所有體外培養(yǎng)細(xì)胞,包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快(實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比稀少時(shí)要快)。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。
  所謂細(xì)胞“一代”一詞,系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞,即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細(xì)胞一代中,細(xì)胞能倍增3~6次。細(xì)胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段:
  1.潛伏期(Latent Phase):
  細(xì)胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢,可長(zhǎng)達(dá)10~24小時(shí)或更多;連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快,10~30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細(xì)胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細(xì)胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。
  細(xì)胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞,還要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段,才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí),可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無增殖,少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng),約24~96小時(shí)或更長(zhǎng),連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,僅6~24小時(shí);細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí),標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
  2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
  這是細(xì)胞增值旺盛的階段,細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細(xì)胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力好的時(shí)期,因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)好的和主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖,導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,使細(xì)胞發(fā)生堆積(Piled up)。細(xì)胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營(yíng)養(yǎng)充分,細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂,因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大,培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時(shí),細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念,不應(yīng)混淆。
  3.停滯期(Stagnate Phase):
  細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,細(xì)胞遂停止增殖,進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動(dòng),繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細(xì)胞會(huì)中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下,雖進(jìn)行了傳代,因細(xì)胞已受損,需要恢復(fù),至少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后,才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間,這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。
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