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病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株有什么優(yōu)勢(shì)?

更新時(shí)間:2018-10-27      點(diǎn)擊次數(shù):2071
  病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株有什么優(yōu)勢(shì)?
  化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法和電轉(zhuǎn),整合率低,同時(shí)整合位點(diǎn)不穩(wěn)定,易發(fā)生再次丟失的情況,而且整合位點(diǎn)一般都在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)之外,所以并不是理想的穩(wěn)定整合工具。另外,整合后的拷貝數(shù)是由核內(nèi)的外源DNA局部濃度,而不是轉(zhuǎn)染時(shí)的DNA的量決定,而化學(xué)方法在輸入質(zhì)粒載體入核的效率比電轉(zhuǎn)和病毒載體相比要低得多,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞所用質(zhì)粒載體用量要大大高于其它方法,造成入核質(zhì)粒載體量難以控制,這也解釋了為什么化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和其它兩種方比,更傾向于得到串聯(lián)多拷貝。以上種種因素,導(dǎo)致使用非病毒載體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定株,成功率低,穩(wěn)定性差,穩(wěn)定克隆株易出現(xiàn)不均一(含有非整合細(xì)胞)等缺點(diǎn)。
  逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于整合率高,是非常理想的穩(wěn)定株構(gòu)建工具。而且通過控制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)條件,理論上可以確保每個(gè)細(xì)胞只有單拷貝插入。同時(shí)由于病毒載體是通過病毒重組酶將外源片段整合入染色體中,其整合特性和病毒自身整合特性非常相似:偏向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)段,且整合后非常穩(wěn)定,在傳代100次后仍然保留在宿主基因組中。重要的是整合幾率和所有其它化學(xué),物理轉(zhuǎn)染方法比,增加5至6個(gè)數(shù)量,使得穩(wěn)定株構(gòu)建不再成為實(shí)驗(yàn)研究的障礙。由于整合幾率非常高,所以很容易獲得混合穩(wěn)定株。
  腺病毒載體整合率和普通轉(zhuǎn)染方法差異不大,被認(rèn)為是不能整合的一類病毒載體,因此相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少,不建議用來構(gòu)建穩(wěn)定株。非野生型腺相關(guān)病毒載體(Rep-)整合率較低,但因?yàn)橐吧筒《据d體可以定點(diǎn)將病毒基因組整合于人19號(hào)染色體,所以從安全性和穩(wěn)定性角度來說,潛力都非常巨大。由于諸多因素,研究人員仍然在對(duì)其進(jìn)行改造中,包括考慮到嚙齒類動(dòng)物不含有人19號(hào)染色體對(duì)應(yīng)的整合位點(diǎn)序列。
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